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Abstrait

La procédure de préparation de nanoparticules noisomes par mélange microfluidique pour l'administration d'ARNsi

Mohammed A. Obeid

L'interférence ARN implique la dégradation d'un ARN messager cible par l'incorporation d'ARN interférents courts (siRNA) [1]. L'interférence ARN (ARNi), l'outil biologique le plus populaire par lequel l'ARN double brin (dsRNA) provoque le silençage génique en ciblant l'ARNm complémentaire pour la dégradation, est une innovation considérable dans le traitement thérapeutique universel des maladies et transforme la façon dont les chercheurs étudient la fonction des gènes. En élargissant les connaissances sur les composants subatomiques de l'impédance de l'ARN endogène, les siRNA se sont développés en tant que médicaments nucléo-acides imaginatifs pour le traitement de maladies mortelles, par exemple les tumeurs malignes.

Les petits ARN interférents (siRNA) sont des atomes d'ARN interférents doubles de 19 à 23 nucléotides de long, combinés de manière trompeuse. Ils sont couramment utilisés en science subatomique pour atténuer temporairement la qualité de l'intrigue. Ils stimulent la réaction de l'ARN interférent après avoir été traduits par leur transcription cible en fonction de la complémentarité de la succession. Ils ont été utilisés à juste titre pour étudier l'impact de différents lncRNA oncogènes par la perte de capacité.

L'ARNsi a ouvert de nouvelles perspectives au développement de médicaments innovants pour traiter des maladies déjà graves, telles que le cancer. Il est d'une efficacité naturelle car il utilise la voie endogène de l'ARNi, permet une réduction explicite des gènes associés à la maladie et est adapté à toute maladie ayant un schéma thérapeutique corrélatif. Pour la base du traitement de qualité par siRNA, la nature génétique de la maladie offre un soutien puissant. En fait, divers siRNA ont été conçus pour cibler des oncogènes prédominants, des oncogènes viraux associés à la cancérogénèse ou des oncogènes mal dirigés.

Mécanisme:

L'étape initiale de l'ARNi comprend la manipulation et le clivage d'un ARN double brin plus long en siRNA, portant généralement un surplomb de 2 nucléotides à l'extrémité 3' de chaque brin. La protéine responsable de cette manipulation est un catalyseur de type RNase III appelé Dicer. Une fois formés, les siRNA sont limités par un complexe de fragments multiprotéiques appelé RISC (complexe de suppression induit par l'ARN). Dans le complexe RISC, les brins d'ARNsi sont isolés et le brin avec l'extrémité 5' la plus stable est généralement intégré au complexe RISC actif. Le fragment d'ARNsi mononucléotidique antisens contrôle et ajuste alors le complexe RISC sur l'ARNm cible et par l'activité de la protéine synergique RISC, une protéine de la famille des argonautes (Ago2), l'ARNm est séparé.

Méthodes :

Les NISV ont été mis en place par mélange microfluidique, une technique récemment développée utilisée pour préparer des nanoparticules à base de lipides et qui conduit à la création de petites vésicules avec une représentation efficace d'un agent thérapeutique. Pour préparer le NISV, des volumes spécifiques de chaque arrangement de stock des composants NISV ont été combinés pour mettre en place la phase lipidique. La phase lipidique a été infusée dans le golfe principal et la phase liquide dans la deuxième baie du micromélangeur microfluidique, avec la température de mélange réglée à 50 °C. Les rapports de débit d'écoulement (FRR) entre la phase aqueuse et la phase organique ont été fixés à 3:1 et les débits totaux d'écoulement (TFR) des deux phases ont été fixés à 12 ml/min. Cela permet un mélange rapide entre les deux phases à des débits d'écoulement élevés et à une température supérieure à la progression de la phase des lipides. Les dispersions ont ensuite été recueillies à partir du flux de sortie et rapidement affaiblies afin de réduire la teneur finale en éthanol dans la préparation à 6,25 % (v/v). L'évaluation de la cytotoxicité du NISV a été réalisée sur des cellules malignes non petites du poumon (A549) et des cellules de mélanome de souris (B16-F10-LUC). L'ARNsi ciblant la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules copGFP-A549 ou la luciférase dans les cellules B16-F10-LUC a été typifié dans le NISV. La limitation de l'expression de la GFP par l'ARNsi anti-GFP (siGFP) transmis par le NISV a été évaluée par cytométrie de flux, réponse en chaîne par polymérase et maculage Western. Des souris BALB/c nues vaccinées avec des cellules B16-F10-LUC qui déclenchent la luciférase transmettant le mélanome ont été utilisées pour étudier la capacité du NISV à transmettre l'ARNsi in vivo.

Résultats:

Les études de cytotoxicité ont montré que les NISV n'étaient pas nocifs à une concentration inférieure ou égale à 40 µg/ml. Les analyses NISV présentaient une efficacité élevée d'expression de l'ARNsi. Les analyses par lentille grossissante fluorescente et cytométrie en flux ont montré une absorption cellulaire élevée par les cellules par rapport à l'ARNsi nu, qui n'était pas absorbé par les cellules. Le NISV avait la capacité de transmettre le siGFP aux cellules et d'étouffer complètement l'expression du GFP. Ces résultats ont été confirmés en transfectant les cellules B16-F10-LUC productrices de luciférase avec un siRNA anti-luciférase (siLUC). L'estimation du degré d'expression de la luciférase après les transfections de siLUC à l'aide d'un cadre de mesure de la protéine luciférase a montré efficacement la dissimulation de l'expression de la luciférase. Les NISV ont ensuite été utilisés dans des tests in vivo utilisant des souris BALB/c nues. Après perfusion intratumorale, le siLUC a été transmis aux cellules et a inhibé l'expression de la luciférase à un niveau nettement plus élevé que chez les souris récompensées par le siLUC exposé. Ces résultats in vivo confirment la capacité du NISV à transmettre efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules cibles et à inhiber la protéine cible.

Conclusion:

Le NISV a été largement démontré et peut être utilisé comme système de transport pour l'ARNsi. Ces résultats ont montré que le NISV peut être utilisé pour surmonter les obstacles, tels que le faible équilibre et la faible absorption cellulaire, dans les thérapies à base d'ARNsi.