Techniques avancées en biologie et médecine
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Abstrait

Stratégie de détermination de l'état de phosphorylation du récepteur β 1-adrénergique in vivo

Kozo Hayashi et Hiroyuki Kobayashi

Français Le récepteur β1-adrénergique (Adrb1), un membre de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), est un régulateur essentiel de la fonction cardiaque. Tous les GPCR sont phosphorylés à plusieurs endroits et le modèle spécifique de phosphorylation agit comme un « code-barres » pour réguler la fonction du récepteur et les processus physiologiques en aval d'une manière spécifique au tissu. Cependant, on sait peu de choses sur la localisation et la fonction des sites de phosphorylation d'Adrb1 in vivo en raison du manque d'anticorps spécifiques. Comme première étape pour identifier les états de phosphorylation d'Adrb1 et les fonctions associées dans le cœur de souris in vivo, nous avons développé la stratégie expérimentale suivante : 1) identification des sites de phosphorylation d'Adrb1 dépendants de l'agoniste dans le cœur de souris perfusé isolé à l'aide de techniques avancées de phosphoprotéomique ; 2) attribution définitive de ces sites de phosphorylation par des données de spectrométrie de masse (MS) de haute qualité obtenues à partir de cellules HEK 293T surexprimant Adrb1 ; 3) génération de souris knock-in (KI) exprimant Adrb1 fusionné avec le marqueur FLAG à l'extrémité N-terminale pour une purification par immunoaffinité afin de révéler l'état de phosphorylation dans l'organisme vivant ; 4) élucidation des niveaux de phosphorylation à des sites spécifiques d'Adrb1 dans le cœur de souris KI par des mesures MS des rapports d'intensité des ions peptide phosphorylé/peptide non phosphorylé correspondant. En utilisant cette stratégie, nous avons identifié Ser462 à l'extrémité C-terminale d'Adrb1 comme un site de phosphorylation dépendant de l'agoniste dans le cœur de souris perfusé. Nous avons également révélé les rapports de phosphorylation basale à Ser274 (0,25), Ser417 (0,55) et Ser462 (0,0023) chez les souris KI. Ces résultats fournissent de nouvelles perspectives sur les mécanismes de régulation de la fonction Adrb1 médiés par la phosphorylation spécifique au site.