Journal des essais cliniques
Libre accès

Abstrait

Détection sensible du récepteur T790M du facteur de croissance épidermique à l'aide de la PCR en temps réel BNAClamp

Austin Dinkel, Rachel A. Hoffmeister, Andrew Huckelby, Aaron S. Castro, Miguel M. Castro, SungKun Kim*

Les mutations sur le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) provoquent une variété de cancers, notamment les cancers du sein et du poumon. La mutation unique T790M sur le domaine de la tyrosine kinase de l'EGFR signifie la réponse aux médicaments contre le cancer gefitinib, ce qui conduit au développement d'une résistance à un tel médicament. La détection de la mutation offre ainsi des options thérapeutiques efficaces pour les patients qui ont besoin de traitements contre le cancer. Nous avons cherché à développer une méthode de détection facile et rapide pour la mutation T790M en utilisant des acides nucléiques pontés (BNA), qui sont connus pour améliorer l'affinité d'hybridation des oligonucléotides. Des oligonucléotides contenant des bases BNA, appelés BNA-clamp et conçus pour bloquer la réaction de PCR contre les gènes de type sauvage ont été utilisés pour distinguer la présence de gènes mutants mélangés à un grand nombre de gènes de type sauvage. La PCR en temps réel en conjugaison avec le BNA-clamping nous permet d'observer différents degrés d'amplification PCR en fonction du rapport entre les gènes de type sauvage et les gènes mutants. Afin d'explorer cette possibilité, plusieurs pinces oligonucléotidiques 13-mer ont été préparées avec différents nombres de bases BNA. L'analyse de la valeur Tm suggère que les pinces contenant 9 bases BNA (BNA-clamp-9) seraient les plus efficaces pour distinguer le gène mutant du gène sauvage, et les tests de sensibilité utilisant BNA-clamp-9 ont révélé que la pince avait la capacité de détecter des niveaux de 0,1 % ou moins de la mutation T790M parmi les gènes sauvages. De plus, les structures de liaison ont été analysées via des simulations de dynamique moléculaire (MD), révélant que BNA-clamp-9 déforme la structure BDNA construite à l'origine. De plus, grâce à un échantillonnage en parapluie, des énergies libres de liaison de -60 kJ/mol pour le gène sauvage et de -40 kJ/mol pour le gène mutant ont été obtenues. Cette technologie de serrage BNA et de PCR en temps réel pourrait offrir une voie prometteuse pour détecter des mutations cliniquement importantes à l'avenir