Journal d'ophtalmologie clinique et expérimentale
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Abstrait

Recherche de variantes alternativement épissées du domaine phospholipase contenant 2 (Pnpla2), un nouveau gène de la rétine

Jacqueline Talea DesJardin, S Patricia Becerra et Preeti Subramanian

Objectif : Ensembl et d'autres bases de données de séquences exprimées (EST) révèlent des variantes d'épissage alternatives putatives chez la souris et le rat pour Pnpla2 , le gène codant pour le récepteur du facteur dérivé de l'épithélium pigmentaire (PEDF-R). Le but de cette étude était d'obtenir des preuves expérimentales de variantes d'épissage Pnpla2 chez la souris.

Matériel et méthodes : Des cultures d'une lignée cellulaire de souris dérivée de photorécepteurs (cellules 661W) et de tissus oculaires, cardiaques, adipeux, rénaux et hépatiques de souris ont été utilisées. L'ARN messager (ARNm) a été isolé des cellules et des tissus, et l'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé. Des paires d'amorces de réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont été conçues pour flanquer les sites d'épissage putatifs. La PCR en temps réel par exclusion d'exons a été utilisée pour réduire l'amplification du transcrit Pnpla2 pleine longueur et améliorer l'amplification des variantes d'épissage peu abondantes. Les produits de PCR ont été résolus par électrophorèse sur gel d'agarose et détectés avec un transilluminateur UV. Des plasmides recombinants contenant un ADNc PNPLA2 pleine longueur humaine ou un ADNc PNPLA2 dépourvu d'exon 5b (E5b) ont été utilisés comme témoins pour valider les techniques. Des lysats cellulaires totaux provenant de cellules 661W ont été préparés. La détection de la protéine PEDF-R a été réalisée à l'aide de transferts Western.

Résultats : Les produits de PCR pour les transcrits Pnpla2 obtenus à partir de cellules 661W ou de divers tissus de souris se sont résolus en une seule bande après amplification avec plusieurs paires d'amorces. L'amplification simultanée de deux ADNc PNPLA2 à divers rapports molaires a empêché la détection de transcrits moins abondants. Cependant, même lorsque l'ADNc pour le transcrit Pnpla2 complet a été exclu de manière significative à l'aide de la méthode d'exclusion des exons, aucune bande correspondant aux variantes d'épissage Pnpla2 n'a été détectable. Néanmoins, les Western blots de lysats de cellules 661W totaux avec deux anticorps différents ont révélé des isoformes pour la protéine PEDF-R.

Conclusions : Les données fournissent la preuve de l’existence d’un seul transcrit Pnpla2 complet qui pourrait donner naissance à un seul produit protéique qui subit un traitement post-traductionnel.