Journal des méthodes de diagnostic médical
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Abstrait

Revalidation du test de dispersion de la chromatine des spermatozoïdes et du test des comètes à l'aide d'études comparatives entre des spermatozoïdes humains purifiés sans et avec fragmentation de l'ADN en phase terminale

Satoru Kaneko*, Kiyoshi Takamatsu

Objectifs : Réaliser des études intercomparatives pour revalider les principes et les performances quantitatives du test de dispersion de la chromatine des spermatozoïdes (SCD) et du test des comètes (CA).

Méthodes : Les spermatozoïdes humains sans et avec fragments granulaires en phase terminale de fragmentation ont été purifiés à partir de sperme normozoospermique et utilisés comme témoins négatifs et positifs naturels (respectivement NC et PC). Le SCD et le CA ont extrait les nucléoprotéines avec 2,0 mol/L de NaCl et 1,0 mmol/L de DTT. Le SCD a déterminé que les dommages à l'ADN étaient inversement proportionnels à la surface du halo violet. Le CA a estimé le niveau de dommages à l'ADN par électrophorèse à partir du nombre de fragments granulaires, appelés queue de comète, dont les caractéristiques électrophorétiques ont été comparées à l'électrophorèse sur gel à champ pulsé à cellule unique (SCPFGE).

Résultats : Le halo violet dans le SCD a été déterminé comme étant constitué de nucléoprotéines colorées au violet de cristal (CV) qui adhéraient aux fibres d'ADN irradiées. Le SCD n'a pas pu faire la distinction entre NC et PC. Les nucléoprotéines résiduelles ont bloqué la migration de l'ADN dans le CA naturel ; en revanche, le SCPFGE avec digestion tryptique en gel a déchargé les fragments fibreux et granulaires au-delà des fibres d'ADN allongées. Le CA alcalin a été traité avec de l'ADN dans 0,3 mol/L de NaOH. Bien que l'ADN ait été déchiqueté en fragments granulaires, les nucléoprotéines résiduelles ont conservé leur capacité de liaison à l'ADN et ont quand même fixé les fragments nouvellement générés.

Conclusion : Les analyses de fragmentation de l'ADN nécessitent de mesurer un stade précoce de fragmentation dans les spermatozoïdes mobiles séparés, un manque de protéolyse diminue les performances quantitatives des CA neutres et alcalines. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que les SCD et les CA ne sont pas suffisamment sensibles comme outils pour récolter des données pour les statistiques cliniques.