Journal de thermodynamique et de catalyse
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Abstrait

L'hydrophobicité réduite de la boucle d'intercalation du sillon mineur est essentielle pour une catalyse efficace par l'uracile-ADN N-glycosylase adaptée au froid de la morue de l'Atlantique

Elin Moe, Netsanet Gizaw Assefa, Ingar Leiros, Kathrin Torseth, Arne O Smalås et Nils Peder Willassen

La boucle d'intercalation du sillon mineur (boucle leucine) des Uracile-ADN N-glycosylases (UNG) subit des changements conformationnels significatifs lors de l'interaction avec le substrat. Des études antérieures ont montré que l'UNG de morue de l'Atlantique adaptée au froid (cUNG) possède une efficacité catalytique dix fois supérieure à celle de l'UNG humaine (hUNG). Un alignement de séquences des deux enzymes a révélé des substitutions d'acides aminés dans et près de la boucle leucine de la cUNG, ce qui peut augmenter l'élasticité de la boucle et ainsi expliquer l'efficacité catalytique supérieure observée de la cUNG par rapport à la hUNG. Afin d'étudier cette hypothèse, nous avons construit cinq mutants simples et quatre mutants multiples de cUNG avec des substitutions de la morue à l'UNG humaine et les avons caractérisés par des expériences cinétiques à trois températures différentes (15, 22 et 37°C) et par calorimétrie différentielle à balayage (DSC). Français Les résultats ont montré que les mutations affectaient davantage le kcat que le KM, et que les mutants aux propriétés hydrophobes apparemment réduites (A266T, V267A, A266T/V267A et A266T/V267A/A274V) présentaient un kcat accru ou équivalent à celui de cUNG, tandis que les mutants dont l'hydrophobicité prédite était accrue (A274V, H275Y, L279F, A266T/V267A/A274V/H275Y et A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q) présentaient un kcat réduit par rapport à cUNG. Ainsi, l'imitation de la composition en acides aminés de la boucle leucine dans hUNG réduit l'activité de cUNG. Les expériences DSC ont été réalisées afin d'identifier une augmentation potentielle de la stabilité globale des mutants en raison de l'hydrophobicité altérée de la boucle leucine. Cependant, les résultats ont montré une légère réduction de la stabilité globale pour les mutants avec kcat augmenté et une stabilité accrue pour les mutants avec kcat réduit. Nous suggérons que ces résultats découlent d'un besoin de compenser une élasticité potentiellement accrue/réduite de la boucle leucine introduite par les substitutions d'acides aminés. Cette étude confirme l'importance suggérée de la boucle leucine pour une catalyse efficace de l'UNG et montre qu'il est possible de modifier la capacité catalytique de cette enzyme en manipulant la composition en acides aminés de cette boucle.