Journal of Glycomics & Lipidomics
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Abstrait

Analyse des N-glycanes sur des anticorps monoclonaux à l'aide de MALDI-Q-IT-TOF

Gulce Özmen

Les anticorps monoclonaux (MAbs) sont de plus en plus utilisés pour le traitement du cancer ou d'autres maladies auto-immunes. La structure glycanique correcte des MAbs est essentielle pour l'activité fonctionnelle et biologique de l'MAb associé, comme l'identification des antigènes déclenchés par les cellules du système immunitaire, la régulation des activités de signalisation et les propriétés physico-chimiques des produits thérapeutiques produits, etc. Par conséquent, la surveillance rapide de la structure glycanique est très importante pour la production de médicaments thérapeutiques, la production de médicaments biosimilaires et leurs processus de contrôle qualité.

Le principal objectif de cette étude est la caractérisation de la structure glycanique des MAbs. Dans notre étude, la structure glycanique du trastuzumab, utilisé comme médicament pour le traitement du cancer du sein, a été caractérisée. Les N-glycanes ont été libérés enzymatiquement de la structure protéique du trastuzumab par digestion à la trypsine et clivage par la PNGase F (Peptide:N-Glycosidase F). De plus, des procédures spéciales d'échange de tampon et d'extraction en phase solide ont été utilisées à des fins de nettoyage avant la détection MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight- Mass Spectrometry).

Après avoir conçu un traitement et une optimisation d'échantillon appropriés, les glycanes GO, GOF, G1, G1F, GOF-GN ont été clairement détectés par MALDI-Q-IT-TOF MS sans aucun marquage ni utilisation de méthodes de séparation chromatographique supplémentaires.

L'exposé actuel porte sur les aspects théoriques et expérimentaux de la spectrométrie de masse MALDI-Q-IT-TOF pour l'étude des glycanes sur les anticorps monoclonaux. Les procédures de préparation des échantillons et les conseils pour les mesures MALDI-TOF-MS seront abordés et les données originales obtenues à partir de la spectrométrie de masse MALDI-Q-IT-TOF seront présentées.

 La glycosylation est un attribut essentiel pour le développement et la fabrication d'anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAbs) dans l'industrie pharmaceutique. L'analyse conventionnelle des glycanes des anticorps est généralement réalisée par la méthode de chromatographie liquide à interaction hydrophile 2-aminobenzamide (2-AB) (HILIC) après la libération des glycanes. Bien que cette méthode produise des résultats satisfaisants, son utilisation est limitée pour le criblage d'un grand nombre d'échantillons car elle nécessite des réactifs coûteux et prend plusieurs heures, voire plusieurs jours, pour la préparation de l'échantillon. Une méthode d'analyse des glycanes simple et rapide n'était pas disponible. Pour surmonter ces contraintes, nous avons

developed and compared 2 ultrafast methods for antibody glycan analysis (UMAG) that involve the rapid generation and purification of glycopeptides in either organic solvent or aqueous buffer followed by label-free quantification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry. Both methods quickly yield N-glycan profiles of test antibodies similar to those obtained by the 2-AB HILIC-HPLC method. In addition, the UMAG method performed in aqueous buffer has a shorter assay time of less than 15 min, and enables high throughput analysis in 96-well PCR plates with minimal sample handling. This method, the fastest, and simplest as reported thus far, has been evaluated for glycoprofiling of mAbs expressed under various cell culture conditions, as well as for the evaluation of antibody culture clones and various production batches. Importantly the method sensitively captured changes in glycoprofiles detected by traditional 2-AB HILIC-HPLC or HILIC-UPLC. The simplicity, high speed, and low cost of this method may facilitate basic research and process development for novel mAbs and biosimilar products.

(MALDI) source, a Quadrupole Ion Trap (QIT) and a Reflectron Time of Flight (reToF) Mass Spectrometer (MS) has been developed. Computer simulations have been carried out to model different methods for efficiently introducing MALDI ions into the QIT and for subsequently extracting ions from the QIT to a dual-stage gridless reToF. The parameters for the system were optimized to get near 100% trapping efficiency and the highest mass resolution. A prototype instrument was built to realize the performance predicted from the computer simulations. Methods for the near orthogonal laser irradiation of a sample, fast switching of large amplitude Radio Frequency (RF) voltages and a gridless dual-stage reflectron were developed. These new developments were combined with a number of other already known techniques to provide the facility to perform high efficiency ion trapping and MS/MS and higher (MSⁿ) analysis. High mass spectra for m/z up to 16,000 have been obtained, and MS³ experiments have been successfully carried out. A sensitivity of 0.1 fmol has been achieved at a mass resolution exceeding 3,000.

Les anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAbs) sont des glycoprotéines produites par des systèmes cellulaires vivants. Les fragments glycanes attachés aux protéines peuvent affecter directement la stabilité, la bioactivité et l'immunogénicité des protéines. Par conséquent, les variantes glycanes d'un produit glycoprotéique doivent être analysées et contrôlées de manière adéquate pour garantir la qualité du produit. Cependant, la complexité inhérente à la glycosylation des protéines pose un défi analytique de taille. Cette revue fournit une mise à jour des avancées récentes dans l'analyse des glycanes, y compris l'utilité potentielle des microarrays à base de lectine pour le profilage des glycanes à haut débit. L'accent est mis sur la comparaison des principaux types d'analyses à utiliser pour déterminer les caractéristiques uniques des glycanes telles que le site de glycosylation, la structure des glycanes et le contenu.

Biographie

Elle a obtenu son diplôme de licence en biochimie à la Faculté des sciences de l'Université d'Ege en 2006. Elle prépare actuellement sa thèse de master sur « l'analyse des glycanes des anticorps monoclonaux » et elle sera diplômée à l'été 2017. Parallèlement, elle travaille comme chercheuse scientifique au Centre de recherche et développement de médicaments et d'applications pharmacocinétiques (ARGEFAR) depuis 2008. Son expérience professionnelle comprend l'utilisation des techniques HPLC, LC MS, MALDI TOF MS. Ses intérêts de recherche couvrent la caractérisation physicochimique des médicaments biosimilaires et des produits biopharmaceutiques.