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Abstrait

Molécules fonctionnelles recombinantes du CMH de classe II et tests de liaison peptidique à haut débit

Sune Justesen, Mikkel Harndahl, Kasper Lamberth, Lise-Lotte B Nielsen

Contexte : Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (MHC-II) se lient spécifiquement et présentent des épitopes peptidiques d'origine exogène aux cellules T auxiliaires CD4+. Le polymorphisme extrême du MHC-II entrave l'analyse complète de la liaison peptidique. Il constitue également un obstacle important à la génération de molécules MHC-II comme réactifs pour étudier et manipuler les réponses spécifiques des cellules T auxiliaires. Des méthodes permettant de générer des molécules MHC-II fonctionnelles par recombinaison et de mesurer leur interaction avec les peptides seraient hautement souhaitables ; cependant, aucune méthodologie consensuelle n'a encore émergé. Résultats : Nous avons généré des constructions de chaînes MHC-II α et β, où les régions traversant la membrane ont été remplacées par des motifs de dimérisation, et le C-terminal des chaînes β a été fusionné à un peptide signal de biotinylation (BSP) permettant la biotinylation in vivo. Ces chaînes ont été produites séparément sous forme de corps d'inclusion dans E. coli, extraites dans l'urée et purifiées dans des conditions dénaturantes et non réductrices à l'aide d'une chromatographie sur colonne classique. Par la suite, la dilution des deux chaînes dans une réaction de repliement avec un peptide approprié a permis la formation efficace d'un complexe peptide-MHC-II. Plusieurs formats différents de test de liaison de peptides ont été développés, notamment un test de liaison homogène, non radioactif et à haut débit (HTS). Des isothermes de liaison ont été générées, ce qui a permis de déterminer les affinités d'interaction. Les affinités des meilleurs liants se situaient dans la gamme nanomolaire inférieure. Des molécules MHC-II recombinantes et un test de liaison peptidique HTS associé ont été développés avec succès pour neuf molécules MHC-II différentes, notamment DPA1*0103/DPB1*0401 (DP401) et DQA1*0501/DQB1*0201, où les chaînes α et β sont polymorphes, illustrant les avantages de la production séparée des deux chaînes. Conclusion : Nous avons développé avec succès des ressources MHC-II polyvalentes, qui peuvent aider à la génération de réactifs, de données et d'outils pour l'ensemble de la classe II du MHC.