Journal des techniques de chromatographie et de séparation
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Abstrait

Comparaison des stratégies de purification de trois isoenzymes de peroxydase de raifort produites par recombinaison dans Pichia pastoris

Rajamanickam V, Winkler M, Flotz P, Meyer L, Herwig C et Spadiut O

La peroxydase de raifort (HRP), une glycoprotéine polyvalente contenant de l'hème fréquemment utilisée dans les diagnostics médicaux, est principalement isolée à partir de plantes. Ce processus implique une filtration, une précipitation au sel et plusieurs étapes de chromatographie, ce qui est coûteux, produit de faibles rendements et donne des mélanges d'isoenzymes. Bien que des isoenzymes simples puissent être produites de manière recombinante dans Pichia pastoris, elles sont hyperglycosylées dans la levure, ce qui rend le processus en aval fastidieux et donc non compétitif. Dans cette étude, nous avons analysé la purification de trois isoenzymes HRP différant par le nombre de sites de N-glycosylation produits de manière recombinante dans P. pastoris. Nous voulions 1) déterminer les corrélations potentielles entre le mode de production de protéines et la qualité du produit résultant et le processus en aval, 2) étudier les corrélations entre le nombre de sites de N-glycosylation de la HRP et le mode de purification, et 3) trouver la stratégie de purification optimale pour les isoenzymes HRP produites de manière recombinante. Ainsi, nous avons appliqué différentes stratégies de culture et testé des processus en aval en utilisant à la fois des résines à base de particules ainsi que des supports monolithiques. Nous avons montré que le mode de culture affectait la pureté du produit mais pas le processus en aval. La purification de chacune des trois isoenzymes HRP à l'aide de supports monolithiques a été réussie et indépendante du nombre de sites de N-glycosylation, tandis que la purification par des résines à base de particules a été fortement affectée par la glycosylation. En résumé, nous avons démontré une nouvelle faisabilité de l'utilisation de monolithes fonctionnant en mode flux continu pour la purification de biomolécules relativement petites .