Journal de pharmacie appliquée
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Abstrait

Coexpression de la protéine de fusion Cyt b5-CYP3A4 génétiquement modifiée avec POR dans les cellules d'insectes Sf9 et caractérisation fonctionnelle des produits exprimés in vitro

Zhangming Xie, Shabbir Ahmed, Wenhui Liu, Sisi Kong, Yingchun Xu, Ting Liu et Shuqing Chen

Le cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) humain est l'enzyme de métabolisation des médicaments de phase I la plus abondante dans le foie, et environ 50 % des médicaments sur le marché sont métabolisés par le CYP3A4. Par conséquent, de nombreuses études in vitro se sont appuyées sur le CYP3A4 recombinant comme outil de dépistage pour évaluer les interactions médicamenteuses potentielles (IDM) in vivo. Cependant, les informations disponibles concernant le CYP3A4 recombinant à forte activité catalytique sont limitées. Ainsi, la présente étude visait à obtenir un CYP3A4 recombinant à forte activité catalytique et à caractériser ses fonctions in vitro. Pour améliorer les activités catalytiques du CYP3A4 exprimé de manière hétérologue, l'enzyme a été fusionnée au cytochrome b5 (b5) en queue-à-tête, et l'enzyme fusionnée a été insérée avec la NADPH–P450 réductase (POR) dans un seul plasmide pour obtenir une expression simultanée dans les cellules sf9. Français Ici, les affinités de liaison du substrat, les activités enzymatiques et les applications dans les DDI in vitro de l'enzyme fusionnée ont été étudiées. La constante de dissociation Kd du POR-cyt b5CYP3A4 était de 8,3 ± 0,87 μmol/L, la Clint (Clint=Vmax/Km) était de 8,57 mL/min/g de protéine pour le POR-cyt b5CYP3A4 dans le métabolisme de la testostérone et de 150,3 mL/min/g de protéine pour le midazolam. De plus, la constante inhibitrice Ki du kétoconazole sur le métabolisme de la testostérone était de 0,013 ± 0,0038 μmol/L. Les présents résultats suggèrent une affinité de liaison du substrat et une activité enzymatique significativement accrues pour l'enzyme fusionnée. Ainsi, la construction pourrait être utile pour étudier les métabolismes des médicaments et l'investigation des DDI associés au CYP3A4 in vitro. De plus, l’expression simultanée de l’enzyme fusionnée et du POR pourrait fournir des résultats plus reproductibles basés sur un rapport molaire plus stable de CYP3A4/POR/b5.