Journal des antiviraux et des antirétroviraux
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Abstrait

Clonage, expression et purification de formes recombinantes de la glycoprotéine EBOV à longueur totale et à domaine extracellulaire dans des lignées cellulaires de mammifères

Misaki Wayengera, Peace Babirye, Carol Musubika, Samuel Kirimunda, Moses L. Joloba

Contexte : La glycoprotéine (GP) du virus Ebola sur toute sa longueur s'intercale dans la membrane lipidique la plus externe pour former des pics, où elle assure l'interaction virus-cellule hôte. Une forme sécrétoire de GP (sGP) est également produite par les 5 espèces connues de virus Ebola . Ces caractéristiques font de la GP une cible idéale pour la recherche et le développement (R et D) de tests de diagnostic rapide (TDR) ciblant le virus Ebola et éventuellement les virus pan-filovirus, les produits biothérapeutiques et les vaccins. Le clonage antérieur de la GP recombinante du virus Ebola du Zaïre ( EBOV ) a principalement utilisé des systèmes d'expression d'insectes ( baculovirus ). Nous rapportons le clonage, l'expression et la purification des formes complètes et du domaine extracellulaire (ECD) de la GP recombinante du virus Ebola du Zaïre dans des lignées cellulaires de mammifères.

Méthodes et résultats : Des séquences d'ADN codantes de 2034 et 1956 paires de bases (pb) correspondant aux résidus de 669 et 643 acides aminés (aa) des formes pleine longueur et ECD de la GP d'EBOV ont été sous-clonées dans les plasmides pTGE. Des plasmides pTGE recombinants ont été utilisés pour transfecter des cellules mammifères HEK 293-6E cultivées dans le milieu d'expression FreeStyleTM 293 sans sérum. Des lysats cellulaires et/ou des surnageants de culture ont été utilisés pour obtenir une protéine purifiée, suivie d'une analyse sur SDS-PAGE et Western blot. La GP pleine longueur purifiée a été détectée comme protéine liée à la membrane dans des lysats cellulaires avec un poids moléculaire estimé à environ 100 kDa (Cal.MW~71,67 kDa) sur Western blot ; et 0,02 mg de GP (concentration : 0,2 mg/mL, pureté : environ 50 %) a été dérivée. Au contraire, l'ECD GP a été détecté dans les surnageants de bouillon de culture cellulaire avec des poids moléculaires estimés à ~116 kDa sur la base de SDS-PAGE et Western blot ; et 1,6 mg (concentration : 0,4 mg/ml, pureté : ~70 %) de GP_ECD ont été obtenus.

Conclusion : Dans les cellules de mammifères, la GP recombinante complète du virus EBOV est principalement exprimée sous forme de protéine transmembranaire (tGP), tandis que la GP ECD est éluée dans le milieu de culture. Les deux formes recombinantes de GP sont essentielles pour la recherche et le développement de tests de diagnostic rapide (TDR).