Journal d'ophtalmologie clinique et expérimentale
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Abstrait

Spectroscopie d'absorption UV et de signal chromatographique amplifié pour évaluer le lysozyme après dénaturation thermique et dans les extraits de lentilles de contact

Claude J Giasson, Danielle Béland et Langis Michaud

Objectif : Amplifier le signal d'absorption lié au lysozyme extrait des lentilles de contact tel que mesuré par chromatographie liquide haute performance (HPLC) ; examiner la pureté du lysozyme et dans quelle mesure la dénaturation thermique affecte son profil d'élution.
Méthodes : Dans les essais chromatographiques au cours desquels des extraits de lentilles de contact ont été injectés dans le système, les fractions collectées entre 4 et 5,5 minutes ont indiqué que le lysozyme était la protéine éluée comme indiqué par un Western blot. Les protéines ont été extraites des lentilles de contact dans une solution 50:50 de 0,2 % d'acide trifluoroacétique (TFA) : acétonitrile (ACN). Chaque extrait de lentille de contact a été séparé en 2 aliquotes. Après évaporation sous vide, les aliquotes n° 1 ont été dissoutes dans la phase mobile initiale pour produire un facteur d'enrichissement de 8. Les aliquotes n° 2 ont été laissées non traitées dans la solution d'extraction habituelle. L'étalonnage du signal d'absorption à 220 nm a permis de mesurer les niveaux de lysozyme dans les chromatogrammes. Français Des injections parallèles des deux aliquotes dans l'HPLC ont permis de comparer leur teneur en lysozyme. La pureté du lysozyme extrait a été évaluée en visualisant son spectre d'absorption sur les pics. Des solutions de lysozyme, préalablement chauffées à 80 et 100°C, ont été injectées et comparées aux solutions témoins. Les différences de teneur médiane en lysozyme entre les aliquotes n° 1 et 2 et de surface de pic du lysozyme chauffé par rapport au témoin ont été testées avec des méthodes non paramétriques.
Résultats : Le taux médian de lysozyme mesuré dans les extraits enrichis et réguliers différait significativement (39,8 et 21,5 μg, respectivement). Cependant, une fois corrigé pour les différents volumes d'injection et facteurs de concentration, le taux moyen de lysozyme enrichi (21,4 μg) était proche de celui trouvé dans l'extrait régulier. L'observation de l'absorbance spectrale suggère que le lysozyme élué est exempt de contaminants. Français Les rapports médians des surfaces de pic du lysozyme chauffé sur la surface de pic du lysozyme témoin différaient significativement de 1 à la température de 100°C (0,91), mais pas à celle de 80°C (0,95) avec le test du rang signé. Même lorsqu'il était chauffé à 80°C, le profil d'élution du lysozyme apparaissait moins symétrique par rapport au témoin et présentait un point d'inflexion supplémentaire. Ces changements subtils étaient accrus à 100°C.
Conclusion : L'enrichissement du lysozyme extrait des lentilles de contact et solubilisé dans la phase mobile initiale améliore la sensibilité de cette procédure chromatographique. Ce protocole chromatographique couplé à la spectroscopie d'absorption UV permet de détecter une dénaturation thermique à 80 et 100°C.