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Essais d'exclusion de colorant en deux étapes spécifiques au sperme pour évaluer l'intégrité des membranes plasmatiques et organelles - Nouvelle approche pour l'assurance qualité du sperme pour l'injection intracytoplasmique de spermatozoïdes

Satoru Kaneko, Yuki Okada, Kiyoshi Takamatsu

Objectif : Les évaluations complètes des membranes plasmiques et organelles constituent une nouvelle approche pour comprendre la fertilité des spermatozoïdes humains. La présente étude a développé 2 types de tests d'exclusion de colorants spécifiques aux spermatozoïdes en 2 étapes pour évaluer les membranes plasmiques et organelles des spermatozoïdes humains.

Méthodes : Test d'exclusion de colorant spécifique du sperme en 2 étapes : le sperme a été incubé avec du rouge réactif 195 (RR195) ou de la concanavaline A conjuguée au Cy3 (Cy3-con A) dans un milieu de culture isotonique, ils ont été contre-colorés avec du bleu réactif 222 ou de la concanavaline A conjuguée à l'Alexa 488 après exclusion de la membrane plasmique avec du méthanol, respectivement. L'intégrité de la membrane de l'organite dans les mitochondries a été observée par rétention du Mito Tracker FM. Le cellROX Orange a produit une fluorescence orange lors de l'oxydation par les espèces réactives de l'oxygène ayant réagi.

Résultats : Le test d'exclusion de colorant spécifique au sperme en 2 étapes consiste en la perméation et la liaison du premier colorant aux noyaux à travers les membranes plasmatiques et organelles endommagées. Après exclusion de la membrane, les noyaux nouvellement exposés ou la membrane acrosomique interne ont été contre-colorés avec le second colorant. Les membranes plasmatiques et acrosomiques intactes des spermatozoïdes mobiles humains (spermatozoïdes vivants ; LS) excluaient RR195 et Cy3-con A, mais ceux dénaturés permettaient les perméations. Le LS colorait en bleu ou produisait une fluorescence verte, d'un côté, ceux dénaturés produisaient une fluorescence rouge ou rouge, respectivement. La fluorescence du Mito Tracker FM et du cellROX Orange dans les mitochondries certifiait la normalité de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries avec une membrane organelle intacte. Le test d'exclusion dérivé en une seule étape du RR195 est un candidat viable pour l'évaluation non destructive peropératoire des spermatozoïdes mobiles en ICSI clinique.

Conclusion : Les tests d'exclusion et de rétention de colorant contribuent aux évaluations préopératoires des qualités des spermatozoïdes et le test d'exclusion de colorant modifié en une seule étape peut être utile pour la sélection peropératoire des spermatozoïdes lors de l'injection intracytoplasmique clinique de spermatozoïdes, respectivement.